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        PCR實驗室入門級別的知識要點

        發布時間:2022/4/7      點擊次數:527

        一、PCR實驗室的設計原則
        原則上應當設置4個區域:試劑儲存和準備區、標本制備區、擴增區、擴增產物分析區。
        根據使用儀器的功能,區域可適當合并。
        使用實時熒光PCR儀,擴增區、擴增產物分析區可合并;
        采用樣本處理、核酸提取及擴增檢測為一體的自動化分析儀,則標本制備區、擴增區、擴增產物分析區可合并。
        各區功能準備物品清單:
        1、試劑儲存和準備區(1區)
        功能:貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴增反應混合液的準備,以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準備。
        準備物品:
        128-20以下冰箱
        2混勻器
        3微量加樣器(覆蓋0.2-1000µl
        2、標本制備區(2區)
        功能:核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管。對于涉及臨床樣本的操作,應符合生物安全二級實驗室防護設備、個人防護和操作規范的要求。
        準備物品:
        12-8冰箱、-20-80冰箱
        2)高速離心機
        3)混勻器
        4)水浴箱或加熱模塊
        5)微量加樣器(覆蓋0.2-1000µl
        6)生物安全柜。
        3、擴增區(3區)
        功能:cDNA合成、DNA擴增及檢測。
        準備物品:核酸擴增儀(或熒光定量PCR儀)
        4、擴增產物分析區(4區)
        功能:擴增片段的進一步分析測定,如雜交、酶切電泳、變性高效液相分析、測序等。
        準備物品:
        1雜交儀、電泳儀、測序儀等
        (2)微量加樣器(覆蓋0.2-1000µl)
        通用物品:(4個區都有可能需要)
        (1)可移動紫外燈(近工作臺面)
        (2)消耗品:一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭
        (3)專用工作服和工作鞋(套)
        (4)專用辦公用品
        (5)樣本管架(2區)
        (6)防爆夾(2區)
        (7)PCR管架(2區、傳遞窗)
        二、PCR實驗室工作基本原則
        1、進入各工作區域應當嚴格按照單一方向進行
        試劑儲存和準備區→標本制備區→擴增區→ 擴增產物分析區。
        2、各工作區域必須有明確的標記,不同工作區域內的設備、物品不得混用。
        3、不同的工作區域使用不同的工作服(例如不同的顏色)。工作人員離開各工作區域時,不得將工作服帶出。
        4、實驗室的清潔應當按試劑貯存和準備區→標本制備區→擴增區→擴增產物分析區的方向進行。不同的實驗區域應當有其各自的清潔用具以防止交叉污染。
        5、工作結束后,必須立即對工作區進行清潔。工作區的實驗臺表面應當可耐受諸如次氯酸鈉的化學物質的消毒清潔作用。實驗臺表面的紫外照射應當方便有效。由于紫外照射的距離和能量對去污染的效果非常關鍵,因此可使用可移動紫外燈(254nm波長),在工作完成后調至實驗臺上60~90cm內照射。由于擴增產物僅幾百或幾十堿基對(bp),對紫外線損傷不敏感,因此紫外照射擴增片段必須延長照射時間,最好是照射過夜。
        6、實驗室的安全工作制度或安全標準操作程序,所有操作符合《實驗室生物安全通用要求》(GB19489-2008)。
        三、注意事項
        1、試劑儲存和準備區
        貯存試劑和用于標本制備的消耗品等材料應當直接運送至試劑貯存和準備區,不能經過擴增檢測區,試劑盒中的陽性對照品及質控品不應當保存在該區,應當保存在標本處理區。
        2、標本制備區
        由于在樣本混合、核酸純化過程中可能會發生氣溶膠所致的污染,可通過在本區內設立正壓條件,避免從鄰近區進入本區的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染,加入待測核酸后,必須蓋好含反應混合液的反應管。對具有潛在傳染危險性的材料,必須在生物安全柜內開蓋,并有明確的樣本處理和滅活程序。
        3、擴增區
        為避免氣溶膠所致的污染,應當盡量減少在本區內的走動。必須注意的是,所有經過檢測的反應管不得在此區域打開。
        4、擴增產物分析區
        核酸擴增后產物的分析方法多種多樣,如膜上或微孔板或芯片上探針雜交方法(放射性核素標記或非放射性核素標記)、直接或酶切后瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern轉移、核酸測序方法、質譜分析等。本區是最主要的擴增產物污染來源,因此必須注意避免通過本區的物品及工作服將擴增產物帶出。在使用PCR-ELISA方法檢測擴增產物時,必須使用洗板機洗板,廢液必須收集至1 mol/L HCl中,并且不能在實驗室內傾倒,而應當至遠離PCR實驗室的地方棄掉。用過的吸頭也必須放至1 mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理,如焚燒。由于本區有可能會用到某些可致基因突變和有毒物質如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或放射性核素等,故應當注意實驗人員的安全防護。



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